IMUNO-HISTOQUÍMICA E IMUNOFLUORESCÊNCIA

Existem vários protocolos para a realização de técnicas em imuno-histoquímica (avidina-biotina-peroxidase, fosfatase alcalina, detecção por polímeros) e imunofluorescência (isotiocianato de fluoresceína).

Aqui disponibilizamos, entre outros, inicialmente, um protocolo clássico, aprimorado, vivido, no Laboratório de Patologia do IOC-FIOCRUZ, com ótimos resultados.pdf

PROTOCOLO CLÁSSICO DE IMUNO-HISTOQUÍMICA (ABP) / IMUNOFLUORESCÊNCIA (FITC)

Regras básicas:

1) Nunca deixe os cortes secarem!;

2) Nenhum protocolo deve ser encarado com rigidez. Se tiver melhorias, implante-as!;

3) Muita atenção e paciência!

OBS. Os fabricantes citados, dos anticorpos e reagentes, podem ser outros equivalentes.

1. Desparafine os cortes em 3 banhos de xilol (2X 5 minutos e 1X 10 minutos) e hidrate-os com a série alcoólica (etanol) a 100%, 95% e 70%, até água destilada, durante 5 minutos cada passo.

2. Iniba a peroxidase endógena tecidual com solução de Metanol (9 partes) + Peróxido de Hidrogênio (H₂O₂) a 30% (1 parte) durante 20 minutos.[OBS: no caso do corte ser de medula óssea faça dois banhos, trocando a solução]. Obviamente, se o procedimento for imunofluorescência não há a necessidade de inibir a peroxidase endógena.

3. Lave bem em TBS (Tris Buffered Saline) pH 7,4 ou em PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, os quais devem estar à temperatura ambiente na hora do uso.

(OBS: Caso não disponha de tampão citrato ou de TUF, faça a digestão enzimática do corte com tripsina: 0,1g de tripsina em 100ml de solução de cloreto de cálcio a 0,1% [0,1g de CaCl₂ em 100ml de água destilada, com o pH ajustado para 7,8. Esta solução deve ser previamente aquecida a 37^oC, na estufa, antes de receber a tripsina]. Deixe as lâminas na posição horizontal, com a tripsina atuando durante 20 a 30 minutos, em câmara úmida, a 37^oC).

4. Troque o TBS, ou o PBS pelo Tampão Citrato de Sódio 10 mM, pH 6,0. Ou lave as lâminas com água deionizada, no caso de ser usado o TUF (item 6).

5. Coloque as lâminas imersas no tampão citrato, no forno de microondas em potência que permita ser atingida uma temperatura de 89⁰C (forno de microondas para laboratório de histologia com sonda de temperatura). Quando a temperatura do tampão citrato atingir 89⁰C, deixe durante dez minutos nesta temperatura. Após isso, tire as lâminas do microondas, deixando-as no mesmo tampão citrato durante mais 20 minutos. [ Não há necessidade do tampão entrar em ebulição]. Caso não tenha forno de microondas, utilize "banho-maria" através de aquecimento em placa quente, com termômetro na solução para controlar a temperatura. Não deixe parte dos cortes ficarem fora do líquido durante o aquecimento.

6. Caso seja usado o “Target Unmasking Fluid” (TUF) [Pharmingem cat. no. 70002T]¹, as lâminas imersas neste fluido devem ser colocadas no microondas, e aí mantidas durante 5 minutos, após ser atingida a temperatura de 89⁰C. A seguir, devem ser retiradas do forno e mantidas no mesmo TUF durante mais 10 minutos. [O TUF 3X concentrado deve ser diluido em água deionizada (ou bidestilada) na proporção de 1 parte de TUF para 2 partes de água deionizada (=33,33ml de TUF em 100ml de solução). Guarde o TUF em frasco fechado, na temperatura ambiente].

7. Faça lavagens com TBS, pH 7,4, ou PBS pH 7,4, de modo a retirar bem, das lâminas, o tampão citrato ou o TUF.

8. Seque as lâminas ao redor dos cortes e coloque, sobre os cortes, BSA a 3% em TBS, ou PBS pH7,4 [= 0,45g de albumina sérica bovina em 15ml de TBS, ou PBS], ou solução de 0,1g de leite em pó desnatado Glória^®, ou Molico^®, em 10ml de BSA a 3%, ou solução de 0,3g de leite em pó desnatado em 10 ml de BSA a 1%, ou solução de 0,3 g de leite em pó desnatado em 10 ml de PBS ou TBS, e deixe as lâminas em câmara úmida, durante 2 horas, à temperatura ambiente do laboratório. Esta etapa é importante para que sejam bloqueadas as possíveis ligações inespecíficas do anticorpo primário. Convém colocar sobre cada corte 150 ou 200 microlitros da solução bloqueadora. Ao usar leite em pó convém preparar as misturas de leite com BSA no dia de usar e filtrar antes do uso (As soluções de BSA a 1% ou a 3% podem ser feitas, previamente, e guardadas no congelador).

9. Escorra o excesso da solução de BSA a 3%, “ou etc”; seque ao redor dos cortes e coloque sobre os mesmos o anticorpo primário diluido na solução de 0,1g de leite em pó desnatado, em 10ml de BSA a 1% [0,15g de albumina sérica bovina em 15ml de TBS, ou PBS, pH 7,4]. Convém colocar sobre cada corte cerca de 150 ou 200 microlitros da solução de anticorpo primário diluido, segundo a área do corte.

10. Deixe os cortes com o anticorpo primário, em câmara úmida, a 4^oC, durante uma noite (de um dia para o outro).

11. Lave 3 vezes em TBS, ou PBS pH 7,4: lavagens de 3, 5 e 7 minutos respectivamente, em agitação suave.

12. Seque ao redor dos cortes e aplique sobre os mesmos o Anticorpo Secundário Biotinilado [TÉCNICA AVIDINA BIOTINA PEROXIDASE (ABP)], ou o anticorpo secundário fluoresceinado(FITC) [TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA], ambos diluidos na solução de BSA a 1%, acrescida ou não de 0,1 g de leite em pó desnatado.

13. Deixe o anticorpo secundário agir durante 45minutos a 1 hora, em câmara úmida, à temperatura ambiente do laboratório.

14. Lave as lâminas 3 vezes em TBS, ou PBS pH 7,4; lavagens de 3, 5 e 7 minutos, respectivamente, sob leve agitação.

15. ABP: Seque ao redor dos cortes e coloque sobre os mesmos o Complexo Estreptavidina-Biotina-Peroxidase [StreptABC Complex/HRP (Dako No. K0377) (40:g/ml= 1,9:l de StreptABC Complex/HRP diluidos em 98,1:l de TBS, ou PBS); ou (30:g/ml= 1,3:l de StreptABC Complex/HRP diluidos em 98,7:l de TBS, ou PBS); ou (10:l de streptavidin/HRP (Dako No. P0397) + 10:l de biotin (Dako No. X0590) + 1ml de TBS, ou PBS)]. No caso de se utilizar o Avidin Biotin Complex (Vector, Vectastain^® ABC Kit No. PK- 4000), pode-se usar a diluição de 1/200; sendo que a alíquota do complexo ABC a ser usada será dividida por dois de modo a se ter o volume em microlitros das soluções A e B do Kit.

FITC: No caso do anticorpo secundário ser fluoresceinado, após secar ao redor dos cortes, cubra os mesmos com solução de AZUL de EVANS (Solução-estoque: 1g de azul de Evans em 1000ml de água destilada. Solução de uso: 10ml da solução-estoque diluidos em 90ml de PBS 0,01M. Ambas as soluções são guardadas a 4^oC). Vá para o item 16.

16. ABP: Deixe o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase atuar durante 45 minutos, em câmara úmida, à temperatura ambiente do laboratório.

FITC: Deixe o azul de EVANS durante 15 minutos, aquecendo a superfície dos cortes, à distância, com “secador de cabelo,” de modo a fixar o corante aos cortes. Cuidado para não secar os cortes!

17. ABP: Lave 3 vezes em TBS, ou PBS; lavagens de 3, 5 e 7 minutos respectivamente, sob leve agitação.

FITC: Lave inicialmente as lâminas com jato de tampão (usar pissete), não diretamente sobre os cortes, e, a seguir, realize as 3 lavagens especificadas logo acima (ABP).

18. ABP: Revele com a solução de 3mg de DAB (Diaminobenzidina)+ 10 ml de TBS ou PBS + 10 :l de Peróxido de Hidrogênio (H₂O₂) a 30%. Acompanhe o desenvolvimento da peroxidase (HRP) observando o corte ao microscópio. O tempo de revelação é em torno de cinco minutos. [Prepare a solução reveladora no momento imediato de usar e proteja-a da luz, usando frasco envolto com papel laminado]. Após a revelação, lave rapidamente as lâminas em água destilada e mantenha-as na água.

19. ABP: Lave os cortes em água destilada: 3 banhos rápidos.

20. ABP: Contracore os cortes com Hematoxilina de Mayer, durante 10 minutos e diferencie em água corrente durante 20 minutos, desidrate, clarifice e monte com lamínula e goma de damar. (A hematoxilina de Mayer não hipercora e não descora com o tempo, segundo o seu protocolo).

FITC: Monte as lâminas, com o anticorpo fluoresceinado, com glicerina anti-“fading” [10ml de PBS, pH 7,6, + 100mg de parafenilenodiamina (P.M. 108,2 - Sigma P-6001) e, a seguir, + 90ml de glicerol tamponado (90ml de glicerol + 10ml de PBS, pH 8,6)]. Guarde em geladeira, em câmara úmida, as lâminas montadas. Examine-as o mais rápido possível, não ultrapassando 2 semanas, após a realização da técnica. Fotomicrografe!

OBS: Na IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA, após a aplicação do anticorpo primário fluoresceinado (FITC), o qual deve ficar atuando durante 2 horas, em câmara úmida, a 37^oC, ou à temperatura ambiente, faça as lavagens conforme o item 14, e siga os procedimentos conforme os itens 15 (Azul de Evans), 16 (FITC), 17 (FITC) e 20 (FITC).

ALGUMAS REFERÊNCIAS CLÁSSICAS:

1) JOHNSON, G.D & ARAUJO, G. M.C.N.- A simple method of reducing the fading of immunofluorescence during microscopy. Journal of Immunological Methods, 43: 349-350, 1981.

2) NITTA, H; MUNGER, W.; WILSON, E.; RALSTON, R. & ALILA, H.- Improved in situ immunodetection of leukocytes on paraffin-embedded mouse spleen. Cell Vision, 4: 73-80, 1997.

3) LEONG, A. S. Y & MILIOS, J. - Rapid immunoperoxidase staining of lymphocyte antigens using microwave irradiation. Journal of Pathology, 148: 183-187, 1986.

4) LEONG, A.S.Y. - An assesment of the efficacy of the microwave antigen-retrieval procedure on a range of tissue antigens. Applied Immunohistochemistry 1: 267-274, 1993.

5) VAN DER BERG, F. et al. - Target unmasking fluid (TUF) for immunohistochemistry in (archival) paraffin-embedded tissue. Eur. Clin. Lab. Feb: p. 24, 1993.

Nota: 1. O Target Unmasking Fluid (TUF) não é bom para a recuperação antigênica de vírus (e.g. Flavivirus e outros).

Protocolo de Imuno-Histoquímica com Sistema de Detecção por Polímero

Tecidos Fixados em Formol e Parafinados

1. Realize cortes de 3 a 4 micrometros de espessura, em lâminas silanizadas [(3-aminopropil)trietoxisilano], ou com carga eletrostática positiva;

2. Acondicione as lâminas na estufa a 60^oC por, aproximadamente, 1 hora;

3. Passe em quatro banhos de xilol, mergulhando as lâminas 10 vezes em cada cuba;

4. Passe em quatro banhos de etanol, mergulhando as lâminas 10 vezes em cada cuba;

5. Lave em água corrente por cinco minutos;

6. Lave em água destilada;

7. Submeta os cortes à recuperação antigênica em tampão de recuperação (veja, embaixo, em Tampões) pré-aquecido a 95^oC, por 30 minutos;

8. Aguarde que as lâminas acondicionadas em tampão atinjam a temperatura ambiente;

9. Lave em água corrente po, aproximadamente, 5 minutos;

10. Lave em água destilada;

11. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4) por 5 minutos (2 vezes).

12. Delimite ao redor dos cortes com caneta hidrofóbica;

13. Submeta os cortes ao bloqueio da peroxidase endógena (peróxido de hidrogênio a 3%), por 20 minutos;

14. Lave em água corrente por, aproximadamente, cinco minutos;

15. Lave em água destilada;

16. Acondicionae as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

17. Submeta os cortes ao bloqueio de proteína (SFB [soro fetal bovino] 10% + BSA [albumina sérica bovina] 1%), por 20 minutos;

18. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

19. Lave em água destilada;

20. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

21. Incube os cortes com o anticorpo primário, a 4^oC, por uma noite, em câmara úmida e ao abrigo da luz;

22. No dia seguinte, retire as lâminas da geladeira e, aguarde atingirem a temperatura ambiente;

23. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

24. Lave em água destilada;

25. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

26. Incube os cortes com anticorpo secundário (sistema de detecção por polímero), por 30 minutos;

27. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

28. Lave em água destilada;

29. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

30. Revele os cortes com DAB (cromógeno + substrato), por 5 minutos;

31. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

32. Lave em água destilada;

33. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

34. Contracore os cortes com hematoxilina, por 1 minuto;

35. Lave em água corrente por, aproximadamente, 10 minutos;

36. Desidrate em etanol, clarifique em xilol e monte o corte na lâmina com lamínula e goma Damar, ou bálsamo.

Tecidos Congelados

1. Realize cortes de 3 a 4 micrometros em lâminas silanizadas [(3-aminopropil)trietoxisilano], ou com carga eletrostática positiva;

2. Lave os cortes com tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (3 vezes)

3. Isole os cortes com caneta hidrofóbica ao redor dos mesmos;

4. Submeta os cortes ao bloqueio da peroxidase endógena (peróxido de hidrogênio a 3%), por 10 minutos;

5. Lave os cortes com água destilada;

6. Lave os cortes com tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (3 vezes);

7. Submeta os cortes ao bloqueio de proteína (SFB [soro fetal bovino] 10% + BSA [albumina sérica bovina] 1%), por 10 minutos;

8. Lave em água destilada;

9. Lave os cortes com tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (3 vezes);

10. Incube os cortes com o anticorpo primário a 4^oC, durante a noite, em câmara úmida e ao abrigo da luz;

11. No dia seguinte, retire as lâminas da geladeira e aguarde atingirem a temperatura ambiente;

12. Lave os cortes com água destilada;

13. Lave os cortes com tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (3 vezes);

14. Incube os cortes com anticorpo secundário (sistema de detecção por polímero, por 30 minutos;

15. Lave os cortes com água destilada, por 5 minutos;

16. Lave os cortes com tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (3 vezes);

17. Revele os cortes com DAB (cromógeno + substrato), por 5 minutos;

18. Lave os cortes com água destilada, por 10 minutos (três trocas);

19. Contracore os cortes com hematoxilina, por 30 segundos;

20. Lave em água corrente por, aproximadamente, 10 minutos;

21. Desidrate em etanol, clarifique em xilol e monte o corte na lâmina com lamínula e goma Damar, ou bálsamo.

Tampão de Lavagem TTBS

TRIS ................................ 6,06 gramas
NaCl .................................... 8,1 grama
Água destilada qsp. ............... 1000mL
Ajuste o pH para 7,4
Acrescente 1mL de Tween (monolaurato de polietilenoglicol [polioxietileno] sorbitano)

Tampões de Recuperação Antigênica para Imuno-Histoquímica

Tampão Citrato

Ácido Cítrico.................... 2,1 gramas
Água destilada qsp. ........... 1000 mL
Ajuste o pH para 6,0

Tampão TRIS/EDTA

TRIS ......................... 1,214 grama
EDTA ....................... .0,372 grama
Água destilada qsp. ...... 1000 mL
Ajuste o pH para 9,0

TRIS = Tris(hidroximetil)aminometano

EDTA = Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

PROTOCOLO PARA DUPLA MARCAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA PELO SISTEMA DE DETECÇÃO POR POLÍMERO HRP/MARROM E AP/VERMELHO (FOSFATASE ALCALINA)

Tecidos fixados em formol e incluídos em parafina.

Se utilizar corte congelado não é necessária a recuperação antigênica.

1. Realize cortes com 3 a 4 micrometros de espessura, em lâminas silanizadas [(3-aminopropil)trietoxisilano], ou com carga eletrostática positiva;

2. Acondicione as lâminas na estufa a 60^oC por, aproximadamente, 1 hora;

3. Passe em quatro banhos de xilol, mergulhando as lâminas 10 vezes em cada cuba;

4. Passe em quatro banhos de álcool, mergulhando as lâminas 10 vezes em cada cuba;

5. Lave em água corrente por 5 minutos;

6. Lave em água destilada;

7. Submeta os cortes à recuperação antigênica em tampão de recuperação (leia embaixo em Tampões), pré-aquecido a 95^oC, por 30 minutos;

8. Aguarde que as lâminas acondicionadas em tampão de recuperação atinjam a temperatura ambiente;

9. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

10. Lave em água destilada;

11. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

12. Isole os cortes, marcando ao redor dos mesmos, com caneta hidrofóbica;

13. Submeta os cortes ao bloqueio da peroxidase endógena (peróxido de hidrogênio a 3%), por 20 minutos;

14. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

15. Lave em água destilada;

16. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

17. Submeta os cortes ao bloqueio de proteína (SFB [soro fetal bovino] 10% + BSA [albumina sérica bovina] 1%), por 20 minutos;

18. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

19. Lave em água destilada;

20. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4) por 5 minutos (2 vezes);

21. Incube os cortes com o anticorpo primário anti-mouse, por 60 minutos, em câmara úmida, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz;

22. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

23. Lave em água destilada;

24. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

25. Incube os cortes com anticorpo secundário anti-mouse (sistema de detecção por polímero HRP/Horseradish Peroxidase) livre de biotina, por 30 minutos;

26. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

27. Lave em água destilada;

28. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

29. Revele os cortes com DAB marrom (cromógeno + substrato), por 5 minutos;

30. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

31. Lave em água destilada;

32. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

33. Submeta os cortes ao bloqueio de proteína (SFB 10% + BSA 1%), por 20 minutos;

34. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

35. Lave em água destilada;

36. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4) por 5 minutos (2 vezes);

37. Incube os cortes com o segundo anticorpo primário anti-rabbit à temperatura ambiente, em câmara úmida e ao abrigo da luz, por 60 minutos;

38. Lave em água corrente por, aproximadamente, cinco minutos;

39. Lave em água destilada;

40. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

41. Incube os cortes com o segundo anticorpo secundário (sistema de detecção por polímero AP) livre de biotina, por 30 minutos;

42. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

43. Lave em água destilada;

44. Acondicione as lâminas em tampão de lavagem (TTBS pH 7,4), por 5 minutos (2 vezes);

45. Revele com substrato/cromógeno (vermelho AP [alkaline phosphatase]), 2 vezes, por cinco minutos;

46. Lave em água corrente por, aproximadamente, 5 minutos;

47. Lave em água destilada;

48. Contracore os cortes com hematoxilina por 1 minuto;

49. Lave em água corrente por, aproximadamente, dez minutos;

50. Desidrate em etanol, clarifique em xilol, e monte os cortes nas lâminas, com lamínula e goma Damar ou bálsamo.

Tampão de Lavagem TTBS

Tampões de Recuperação Antigênica para Imuno-Histoquímica

Tampão Citrato

Ácido Cítrico.................... 2,1 gramas
Água destilada qsp. ........... 1000 mL
Ajuste o pH para 6,0

Tampão TRIS/EDTA

TRIS ......................... 1,214 grama
EDTA ....................... .0,372 grama
Água destilada qsp. ...... 1000 mL
Ajuste o pH para 9,0

TRIS = Tris(hidroximetil)aminometano

EDTA = Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

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Tecidos fixados em formol e incluídos em parafina.

Se utilizar corte congelado não é necessária a recuperação antigênica.

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