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IMUNO-HISTOQUÍMICA E IMUNOFLUORESCÊNCIA

 

Existem vários protocolos para a realização de técnicas em imuno-histoquímica (avidina-biotina-peroxidase) e imunofluorescência (isotiocianato de fluoresceína).

Aqui disponibilizamos um aprimorado, vivido, no Laboratório de Patologia do IOC-FIOCRUZ, com ótimos resultados.pdf

 

PROTOCOLO DE IMUNO-HISTOQUÍMICA / IMUNOFLUORESCÊNCIA

Regras básicas:

1) Nunca deixe os cortes secarem!;

2) Nenhum protocolo deve ser encarado com rigidez. Se tiver melhorias, implante-as!;

3) Muita atenção e paciência!

OBS. Os fabricantes citados, dos anticorpos e regentes, podem ser outros equivalentes.

 

1. Desparafine os cortes em 3 banhos de xilol (2X 5 minutos e 1X 10 minutos) e hidrate-os com a série alcoólica (etanol) a 100%, 95% e 70%, até água destilada, 5 minutos cada passo.

2. Iniba a peroxidase endógena tecidual com solução de Metanol (9 partes) + Peróxido de Hidrogênio (H2O2) a 30% (1 parte) por 20 minutos.[OBS: no caso do corte ser de medula óssea faça dois banhos, trocando a solução]. Obviamente, se o procedimento for imunofluorescência não há a necessidade de inibir a peroxidase endógena.

3. Lave bem em TBS (Tris Buffered Saline) pH 7,4 ou em PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, os quais devem estar à temperatura ambiente na hora do uso.

(OBS: Caso não disponha de tampão citrato ou de TUF, faça a digestão enzimática do corte com tripsina: 0,1g de tripsina em 100ml de solução de cloreto de cálcio a 0,1% [0,1g de CaCl2 em 100ml de água destilada, com o pH ajustado para 7,8. Esta solução deve ser previamente aquecida a 37oC, na estufa, antes de receber a tripsina]. Deixe as lâminas na posição horizontal, com a tripsina atuando por 20 a 30 minutos, em câmara úmida, a 37oC).

4. Troque o TBS, ou o PBS pelo Tampão Citrato de Sódio 10 mM, pH 6,0. Ou lave as lâminas com água deionizada, no caso de ser usado o TUF (item 6).

5. Coloque as lâminas imersas no tampão citrato, no forno de microondas em potência que  permita ser atingida  uma temperatura de 890C (forno de microondas para laboratório de histologia com sonda de temperatura). Quando a temperatura do tampão citrato atingir 890C, deixe por dez minutos nesta temperatura. Após isso, tire as lâminas do microondas, deixando-as no mesmo tampão citrato por mais 20 minutos. [ Não há necessidade do tampão entrar em ebulição]. Caso não tenha forno de microondas, utilize "banho-maria" através de aquecimento em placa quente, com termômetro na solução para controlar a temperatura. Não deixe parte dos cortes ficarem fora do líquido durante o aquecimento.

6. Caso seja usado o “Target Unmasking Fluid” (TUF) [Pharmingem cat. no. 70002T]1, as lâminas imersas neste fluido devem ser colocadas no microondas, e aí mantidas por 5 minutos, após ser atingida a temperatura de 890C. A seguir, devem ser retiradas do forno e mantidas no mesmo TUF por mais 10 minutos. [O TUF 3X concentrado deve ser diluido em água deionizada (ou bidestilada) na proporção de 1 parte de TUF para 2 partes de água deionizada (=33,33ml de TUF em 100ml de solução). Guarde o TUF em frasco fechado, na temperatura ambiente].

7. Faça lavagens com TBS, pH 7,4, ou PBS pH 7,4, de modo a retirar bem, das lâminas, o tampão citrato ou o TUF.

8. Seque as lâminas ao redor dos cortes e coloque, sobre os cortes, BSA a 3% em TBS, ou PBS pH7,4 [= 0,45g de albumina sérica bovina em 15ml de TBS, ou PBS], ou solução de 0,1g de leite em pó desnatado Glória®, ou Molico®, em 10ml de BSA a 3%, ou solução de 0,3g de leite em pó desnatado em 10 ml de BSA a 1%, ou solução de 0,3 g de leite em pó desnatado em 10 ml de PBS ou TBS, e deixe as lâminas em câmara úmida, por 2 horas, à temperatura ambiente do laboratório. Esta etapa é importante para que sejam bloqueadas as possíveis ligações inespecíficas do anticorpo primário. Convém colocar sobre cada corte 150 ou 200 microlitros da solução bloqueadora. Ao usar leite em pó convém preparar as misturas de leite com BSA no dia de usar e filtrar antes do uso (As soluções de BSA a 1% ou a 3% podem ser feitas, previamente, e guardadas no congelador).

9. Escorra o excesso da solução de BSA a 3%, “ou etc”; seque ao redor dos cortes e coloque sobre os mesmos o anticorpo primário diluido na solução de 0,1g de leite em pó desnatado, em 10ml de BSA a 1% [0,15g de albumina sérica bovina em 15ml de TBS, ou PBS, pH 7,4]. Convém colocar sobre cada corte cerca de 150 ou 200 microlitros da solução de anticorpo primário diluido, segundo a área do corte.

10. Deixe os cortes com o anticorpo primário, em câmara úmida, a 4oC, por uma noite (overnight).

11. Lave 3 vezes em TBS, ou PBS pH 7,4: lavagens de 3, 5 e 7 minutos respectivamente, em agitação suave.

12. Seque ao redor dos cortes e aplique sobre os mesmos o Anticorpo Secundário Biotinilado [TÉCNICA AVIDINA BIOTINA PEROXIDASE (ABP)], ou o anticorpo secundário fluoresceinado(FITC) [TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA], ambos diluidos na solução de BSA a 1%, acrescida ou não de 0,1 g de leite em pó desnatado.

13. Deixe o anticorpo secundário agir por 45minutos a 1 hora, em câmara úmida, à temperatura ambiente do laboratório.

14. Lave as lâminas 3 vezes em TBS, ou PBS pH 7,4; lavagens de 3, 5 e 7 minutos, respectivamente, sob leve agitação.

15. ABP: Seque ao redor dos cortes e coloque sobre os mesmos o Complexo Estreptavidina-Biotina-Peroxidase [StreptABC Complex/HRP (Dako No. K0377) (40:g/ml= 1,9:l de StreptABC Complex/HRP diluidos em 98,1:l de TBS, ou PBS); ou (30:g/ml= 1,3:l de StreptABC Complex/HRP diluidos em 98,7:l de TBS, ou PBS); ou (10:l de streptavidin/HRP (Dako No. P0397) + 10:l de biotin (Dako No. X0590) + 1ml de TBS, ou PBS)]. No caso de se utilizar o Avidin Biotin Complex (Vector, Vectastain® ABC Kit No. PK- 4000), pode-se usar a diluição de 1/200; sendo que a alíquota do complexo ABC a ser usada será dividida por dois de modo a se ter o volume em microlitros das soluções A e B do Kit.

       FITC: No caso do anticorpo secundário ser fluoresceinado, após secar ao redor dos cortes, cubra os mesmos com solução de AZUL de EVANS (Solução-estoque: 1g de azul de Evans em 1000ml de água destilada. Solução de uso: 10ml da solução-estoque diluidos em 90ml de PBS 0,01M. Ambas as soluções são guardadas a 4oC). Vá para o item 16.

16. ABP: Deixe o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase atuar por 45 minutos, em câmara úmida, à temperatura ambiente do laboratório.

       FITC: Deixe o azul de EVANS por 15 minutos, aquecendo a superfície dos cortes, à distância, com “secador de cabelo,” de modo a fixar o corante aos cortes. Cuidado para não secar os cortes!

17. ABP: Lave 3 vezes em TBS, ou PBS; lavagens de 3, 5 e 7 minutos respectivamente, sob leve agitação.

      FITC: Lave inicialmente as lâminas com jato de tampão (usar pissete), não diretamente sobre os cortes, e, a seguir, realize as 3 lavagens especificadas logo acima (ABP).

18. ABP: Revele com a solução de 3mg de DAB (Diaminobenzidina)+ 10 ml de TBS ou PBS + 10 :l de Peróxido de Hidrogênio (H2O2) a 30%.  Acompanhe o desenvolvimento da peroxidase (HRP) observando o corte ao microscópio.  O tempo de revelação é em torno de cinco minutos. [Prepare a solução reveladora no momento imediato de usar e proteja-a da luz, usando frasco envolto com papel laminado]. Após a revelação, lave rapidamente as lâminas em água destilada e mantenha-as na água.

19. ABP: Lave os cortes em água destilada: 3 banhos rápidos.

20. ABP: Contracore os cortes com Hematoxilina de Mayer, por 10 minutos e diferenciar em água corrente por 20 minutos, desidrate, clarifice e monte com lamínula e goma de damar. (A hematoxilina de Mayer não hipercora e não descora com o tempo, segundo o seu protocolo).

      FITC: Monte as lâminas, com o anticorpo fluoresceinado, com glicerina anti-“fading” [10ml de PBS, pH 7,6, + 100mg de parafenilenodiamina (P.M. 108,2 - Sigma P-6001) e, a seguir, + 90ml de glicerol tamponado (90ml de glicerol + 10ml de PBS, pH 8,6)]. Guarde em geladeira, em câmara úmida, as lâminas montadas. Examine-as o mais rápido possível, não ultrapassando 2 semanas, após a realização da técnica. Fotomicrografe!

OBS: Na IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA, após a aplicação do anticorpo primário fluoresceinado (FITC), o qual deve ficar atuando por 2 horas, em câmara úmida, a 37 oC, ou à temperatura ambiente, faça as lavagens conforme o item 14, e siga os procedimentos conforme os itens 15 (Azul de Evans), 16 (FITC), 17 (FITC) e 20 (FITC).

 

ALGUMAS REFERÊNCIAS:

1) JOHNSON, G.D & ARAUJO, G. M.C.N.- A simple method of reducing the fading of immunofluorescence during microscopy. Journal of Immunological Methods, 43: 349-350, 1981.

2) NITTA, H; MUNGER, W.; WILSON, E.; RALSTON, R. & ALILA, H.- Improved in situ immunodetection of leukocytes on paraffin-embedded mouse spleen. Cell Vision, 4: 73-80, 1997.

3) LEONG, A. S. Y & MILIOS, J. - Rapid immunoperoxidase staining of lymphocyte antigens using microwave irradiation. Journal of Pathology, 148: 183-187, 1986.

4) LEONG, A.S.Y. - An assesment of the efficacy of the microwave antigen-retrieval procedure on a range of tissue antigens. Applied Immunohistochemistry 1: 267-274, 1993.

5) VAN DER BERG, F. et al. - Target unmasking fluid (TUF) for immunohistochemistry in (archival) paraffin-embedded tissue. Eur. Clin. Lab. Feb: p. 24, 1993.

 

Nota: 1. O Target Unmasking Fluid (TUF) não é bom para a recuperação antigênica de vírus (e.g. Flavivirus e outros).

 

LEIA MAIS EM:

Overview of the Immunohistochemistry

Immunohistochemistry vade mecum

Immunofluorescence staining.pdf

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