MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO - PROTOCOLO
MATERIAIS: Pele, rim, nervo periférico, músculo, etc, obtidos por biopsia.
FRAGMENTOS: 1 a 3 milímetros cúbicos.
FIXADOR: Glutaraldeído a 2,5 % em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,4.
SECÇÕES: Cortes semifinos, com 0,5 a 1,0 micrometro e cortes ultrafinos, com 60 a 90 nanometros.
SOLUÇÕES (use balão volumétrico):
TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,2 M, pH 7,4
[cacodilato de sódio = dimetilarsenato de sódio]
Cacodilato de sódio (C2H6AsOONa)τ.......................................... 32 gramas.
Água destilada ...............................................................até completar 1 litro.
τ BIOSSEGURANÇA: O cacodilato de sódio é tóxico, irritante e não inflamável, porém a sua combustão libera arsênio, monóxido de carbono e dióxido de carbono. Trabalhe em local ventilado. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,3 M, pH 7,4
[cacodilato de sódio = dimetilarsenato de sódio]
Cacodilato de sódio (C2H6AsOONa)τ............................................ 48 gramas.
Água destilada .................................................................até completar 1 litro.
τ BIOSSEGURANÇA: O cacodilato de sódio é tóxico, irritante e não inflamável, porém a sua combustão libera arsênio, monóxido de carbono e dióxido de carbono. Trabalhe em local ventilado. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
FERROCIANETO DE POTÁSSIO A 1,6%
Ferrocianeto de potássio [K3Fe(CN)6]τ...................................... 1,6 grama.
Água destilada ................................................. até completar 100 mililitros.
τ BIOSSEGURANÇA: O ferrocianeto de potássio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
GLUTARALDEÍDO A 2,5 % EM TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,2 M, pH 7,4
Solução aquosa de glutaraldeído a 25% [OHC(CH2)3CHO]τ............... 10 mililitros.
Solução de cacodilato de sódio 0,2 M ................................................. 90 mililitros.
τ BIOSSEGURANÇA: O glutaraldeído é corrosivo, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa!
TETRÓXIDO DE ÓSMIO A 2% EM TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,3 M
Tetróxido de ósmio (OsO4)τ............................................................. 2 gramas.
Tampão cacodilato de sódio 0,3M ........................até completar 100 mililitros.
τ BIOSSEGURANÇA: O TETRÓXIDO DE ÓSMIO É VENENOSO. USE-O COM EXTREMO CUIDADO. NÃO INALE OS SEUS VAPORES, POIS PODE LEVAR À MORTE. TRABALHE SOB CAPELA COM EXAUSTÃO. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO DE ACETATO DE URANILA A 7% EM METANOL
Acetato de uranila [UO2(CH3COO)2]τ............................................ 7 gramas.
Metanol (CH3OH)τ..............................................até completar 100 mililitros.
Armazene em frasco escuro (âmbar) e no refrigerador.
τ BIOSSEGURANÇA: O acetato de uranila é muito tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa. Trabalhe em capela com exaustão! O metanol é muito tóxico, inflamável e combustível. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele e as mucosas, além da roupa. Mantenha longe de fontes de calor e de combustíveis. Use roupa protetora.
SOLUÇÃO DE BORATO DE SÓDIO (BÓRAX) A 1%
Borato de sódio (Na2B4O7)..............................................................1 grama.
Água destilada ....................................................até completar 100 mililitros.
SOLUÇÃO DE AZUL DE TOLUIDINA O A 2% EM BORATO DE SÓDIO A 1%
Azul de toluidina O (C.I. 52040)......................................................2 gramas.
Solução de borato de sódio a 1%....................... até completar 100 mililitros.
SOLUÇÃO DE SACAROSE 0,4 M
Sacarose ............................................................................ 136,8 gramas.
Água destilada ...........................................................até completar 1 litro.
PROCEDIMENTO:
1. Clive os fragmentos obtidos por biopsia deixando-os com 1 a 3 milímetros cúbicos para facilitar a fixação.
2. Deixe em solução de glutaraldeído a 2,5 %, em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,4, por 2 horas até 24 horas, a 4oC.
3. Lave em solução (1:1) de tampão cacodilato de sódio 0,2 M, pH 7,4 + sacarose 0,4 M, duas vezes, 10 minutos em cada, a 4oC. (Nota: a sacarose mantém a osmolaridade em 360 a 400 mOsm).
4. Fixe em solução (1:1) de tetróxido de ósmio a 2%, em tampão cacodilato de sódio, 0,3 M + ferrocianeto de potássio a 1,6%, por 1 hora, a 4oC, para manter a osmolaridade em torno de 360 a 400 mOsm (Nota: o ferrocianeto de potássio aumenta o contraste da membrana citoplasmática).
5. Lave em água destilada, por duas vezes, rapidamente.
6. Desidrate em soluções aquosas crescentes de etanol a 30%, 50%, 70% e 90%, 10 minutos em cada. A seguir em etanol a 100%, 3 vezes, 10 minutos em cada.
7. Desidrate na solução (1:1) de etanol a 100% + óxido de propileno, por 15 minutos.
τ BIOSSEGURANÇA: O óxido de propileno (CH3CH[O]CH2) é irritante, sensibilizante, combustível e inflamável. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa. Mantenha-o longe de fontes de calor e de outros inflamáveis e combustíveis!
8. Desidrate em óxido de propileno puro, 2 vezes, 10 minutos em cada.
9. Faça a impregnação (infiltração) em solução (1:1)de resina epoxi (epoxídica) (Epon 812) + óxido de propileno, por 1 hora, em temperatura ambiente.
10. Faça a impregnação (infiltração) com resina epoxi (epoxídica) (Epon 812) pura, durante 2 dias, por meio de várias trocas durante o dia, para a extração completa dos desidratantes e a substituição total pela resina epoxi.
11. Faça a inclusão (emblocamento) por meio de formas de silicone, em estufa a 60oC, durante 48 horas, para a confecção dos blocos de resina epoxi.
12. Faça, em ultramicrótomo, cortes semifinos, com 0,5 a 1,0 micrometro, e core-os em solução aquosa de azul de toluidina a 1% em borato de sódio (bórax) a 1% (mantém o pH alcalino, facilitando a coloração), para observação ao microscópio óptico.
13. Faça, em ultramicrótomo, cortes ultrafinos com 60 a 90 nanometros e contraste-os com acetato de uranila (acetato de urânio) a 7% em metanol, durante 50 minutos, e citrato de chumbo (segundo Reynolds), durante 10 minutos, para a observação em microscópio eletrônico de transmissão.
POP-Microscopia_Eletrônica_de_Transmissão.pdf
AFIP-Advanced-Laboratory-Methods-in-Histology-and-Pathology.pdf
REFERÊNCIA:
Reynolds, E.S. – The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. 17(1): 208-212, 1963.pdf.
