EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS PARAFINADOS

 

Tecidos fixados em formalina ou outro fixador e incluídos em parafina

 

PROCEDIMENTO I

 

 

1. Faça cortes histológicos com 4 µm de espessura. Despreze os dois primeiros cortes e recolha outros 8 cortes num tubo para PCR de 1,5 ml (use um tubo para cada bloco de tecido parafinado). Os tubos, devidamente rotulados, deverão ser guardados em caixa apropriada a -20°C, até a extração do DNA.

2. A navalha do micrótomo deve ser nova. Todo o material usado deverá ter sido devidamente higienizado com etanol. A pessoa que cortar deverá usar luvas livres de talco durante todas as etapas do procedimento. Preferencialmente, a navalha deverá ser trocada para cada novo bloco.

3. Em cada tubo contendo 8 cortes de tecido, coloque, com pipeta, 250 µl da solução de lise celular (50 mM Tris-HCl, pH 8,5 + 5 mM EDTA pH 8,0 + 300 mM NaCl + 1% SDS). Em seguida, incube os tubos a 90°C, por 20 minutos. Após, deixe esfriar até a temperatura ambiente, e mantenha os cortes nesta temperatura por 5 minutos.

4. Acrescente, em cada tubo, 15 µl de proteinase K, diluída a 10 mg/ml. Incube a 56°C, por 48 horas (etapa opcional), no banho seco. O tempo prolongado (48 horas) de incubação aumenta a quantidade de DNA obtido na extração, conforme demonstrado na literatura científica.

5. Em seguida, incube os tubos a 95°C, por 10 minutos, para inativar a proteinase K.

6. Centrifugue à 13.000 rpm, por 10 minutos. O sobrenadante deverá ser transferido para outros tubos para PCR de 1,5 ml (o DNA eluído está no sobrenadante).

7. Deixe atingir a temperatura ambiente. Adicione em cada tubo, aproximadamente, 1/10 de NaCl 5M (cerca de 20 µl), e misture usando o agitador tipo Vortex.

8. Adicione 2 volumes de etanol absoluto a -20°C. Misture bem por inversão. Deixe neste etanol, a -20°C, por uma noite (etapa opcional, porém, isto permite potencializar a precipitação do DNA).

9. No dia posterior (etapa opcional), ou no mesmo dia, centrifugue a 10.000 rpm, por 15 minutos. Após, descarte o sobrenadante, gentilmente, por decantação. O DNA vai estar no pellet (sedimento).

10. Ressuspenda o pellet (sedimento) em 500 µl de etanol a 80%. Centrifugue a 10.000 rpm, por 5 minutos. Descarte, gentilmente, o sobrenadante e deixe secar à temperaura ambiente, por 5 a 10 minutos. Esse processo de lavagem com etanol a 80% ajuda a remover os resquícios de sal. O etanol evapora em alguns minutos.

11. O pellet (sedimento) deverá, então, ser ressuspendido em solução tampão TE modificado (10 mM Tris-HCl pH 8,0 + 0,5 mM EDTA pH 8,0). O DNA eluído deverá ser armazenado a -20°C para uso posterior. A modificação da solução tampão TE original foi a redução da concentração de EDTA pela metade. Tal redução foi preconizada pelo fabricante Qiagen. O uso desse tampão (TE modificado) para armazenar o DNA extraído com o QIAmp DNA Isolation Kit obtém DNA de ótima qualidade, mesmo depois de 16 anos armazenado a 4°C ou -20°C.

 

Referências

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Oliveira, M.C.de S. et al. - Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007.pdf

Patel, P.G. et al. - Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction. Journal of Visualized Experiments 2016; (114): 54299.

Pikor, L.A. et al. - DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses. Journal of Visualized Experiments 2011; (49): 2763.

Ren, Z-P. et al. - Recovering DNA and Optimizing PCR Conditions from Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Materials. Pathobiology 2000; 68: 215–217.

Scorsato, A.P. & Telles, J.E.Q. - Fatores que interferem na qualidade do DNA extraído de amostras biológicas armazenadas em blocos de parafina. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial 2011; 47(5): 541-548.

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USP - Video-Aulas - Protocolo de Extração de DNA

Viljoen, H. et al. - Towards molecular autopsies: Development of a FFPE tissue DNA extraction workflow. Science & Justice 2022; 62(2): 137-144.

 

 

 

Marcelo Soares da Mota e Silva

Biologista Molecular

Departamento de Patologia

Faculdade de Medicina - UFRJ

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PROCEDIMENTO II

 

PASSOS BÁSICOS NA EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDO PARAFINADO

 

INTRODUÇÃO

 

O protocolo de extração de DNA consiste em três etapas básicas:

 

1. Etapa de Lise – o primeiro passo consiste em realizar a lise (quebra) da membrana das células teciduais para expor o DNA;

2. Etapa de Lavagem ou Limpeza – consiste em quebrar e emulsionar a gordura e as proteínas que formam a membrana das células. Isto normalmente é feito utilizando-se soluções detergentes e por centrifugação;

3. Etapa de Eluição – por fim, ocorre a liberação dos ácidos nucléicos (DNA/RNA) das células, ficando disponibilizado o DNA purificado, pronto para ser utilizado em diferentes aplicações

 

CUIDADOS

 

1. A amostra tecidual coletada deve ser manuseada com o uso de luvas sem talco, evitando-se, assim, que parte dos ácidos nucléicos sejam degradados por nucleases;

2. Todo material coletado deve ser mantido refrigerado, preferencialmente, à temperatura de -20ºC, até o momento de ser submetido à extração;

3. O DNA deve ser manipulado em ambientes cuidadosamente higienizados com etanol a 70%;

4. O material de polipropileno (plástico) utilizado deve ser esterilizado e novo, e material já utilizado não deve ser aproveitado.

 

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS

 

1. Centrífuga com controle de refrigeração;

2. Capela de exaustão;

3. Banho-maria seco, com termostato ou com termômetro, para aferição da temperatura;

4. Pipetas e ponteiras esterilizadas;

5. Tampão de digestão (Tris HCl pH 8,0 – 10mM + EDTA pH 8,0 – 1mM, + dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,5%, + enzima digestiva [proteinase K 20 µg por mL, adicione apenas no momento de uso]).

6. Etanol absoluto ou Isopropanol (álcool isopropílico);

7. Etanol a 70%;

8. Tampão TE (Tris HCl 10Mm + EDTA 1mM), pH 8,0;

9. Tubos de polipropileno;

10. Vidraria para o preparo de soluções (provetas e pipetas esterilizados).

 

COLETA DA AMOSTRA DE TECIDO DO BLOCO DE PARAFINA

 

1. Selecione a área de interesse do tecido no bloco de parafina;

2. Despreze o primeiro corte;

3. Em um tubo tipo Eppendorf DNAse/RNase livre (free), devidamente identificado, acondicione cinco cortes de 4 micrometros ou, quatro cortes de 5 micrometros da amostra de tecido selecionada;

Obs: utilize uma navalha nova por bloco, e higienize com etanol o equipamento e as pinças na manipulação de cada bloco.

 

DESPARAFINAÇÃO

1. Adicione, à amostra, 1 mL de xilol e deixe agir por 5 minutos, com agitação. Passados os 5 minutos, centrifugue a amostra por, aproximadamente, 2 minutos e, com o auxílio de uma pipeta, retire o sobrenadante. Repita este processo 3 vezes.

2. Adicione 1 mL de etanol absoluto e deixe agir por 5 minutos, com agitação. Passados os 5 minutos, centrifugue a amostra por, aproximadamente, 2 minutos e, com o auxílio de uma pipeta, retire o sobrenadante. Repita este processo 2 vezes.

3. Adicione 1 mL de etanol a 70% e deixe agir por 5 minutos, com agitação. Passados os 5 minutos, centrifugue a amostra por, aproximadamente, 2 minutos e, com o auxílio de uma pipeta, retire o sobrenadante e deixe o tubo aberto, dentro da capela de exaustão, até que o etanol evapore por completo.     

       

I) EXTRAÇÃO - LISE CELULAR (DIGESTÃO)

Este é o primeiro passo, que consiste na ruptura da célula, possibilitando a exposição do DNA/RNA.

1. O sedimento (pellet) do tecido desparafinado deve ser ressuspendido em tampão de lise, antes de ser submetido à digestão enzimática:

1.1. Ressuspenda o sedimento (pellet) em 180 μl de tampão de lise (Tris-HCl pH 8,5 – 10mM, + EDTA pH 8,0 – 5mM + NaCl 50 mM, SDS 1%) - respeitando a proporção de 1,2 mL de tampão para cada 100 mg de tecido;

1.2. Centrifugue a amostra (13.000 rpm), durante breves instantes (aproximadamente 10 minutos);

1.3. Adicione 20 μl da enzima proteinase K à amostra . A proteinase K auxilia na lise e na quebra das histonas acopladas ao DNA.

1.4. Agite com o vórtex.

1.5. Incube a 56°C por, aproximadamente, 24h ou, até a amostra ter sido completamente digerida (fica com aspecto viscoso). O tempo de digestão varia de acordo com o tipo de tecido.

1.6. Incube a 95 °C, por 1 hora.

Obs: A incubação a 95°C é indicada para reverter a ligação cruzada com a formalina.

 

II) EXTRAÇÃO – PURIFICAÇÃO (LAVAGEM)

Esta etapa varia de acordo com o protocolo utilizado.

Caso utilize a técnica fenol-clorofórmio:

Fenol: agente desnaturante  - 25 microlitros;

Clorofórmio: agente desnaturante que auxilia a estabilizar o DNA - 24 microlitros;

Álcool isoamílico: age reduzindo a formação de espuma durante a reação- 1 microlitro.

1. Acrescente 300 microlitros da solução fenol-clorofórmio  à amostra;

1.2. Homogeinize por, aproximadamente, 5 minutos;

1.3. Centrifugue, por 5 minutos, à 13.000rpm.

 

III) EXTRAÇÃO – RECUPERAÇÃO (ELUIÇÃO)

1.1. Após a centrifugação, acondicione o sobranadante (pellet) em um tubo tipo Eppendorf;

1.2. Descarte o sedimento (pellet);

1.3. Adicione, à amostra, 250 µL de etanol 97% a 100% ou Isopropanol, para precipitar o DNA;

1.4. Homogeinize, cuidadosamente, até formar uma “nuvem” esbranquiçada;

1.5. Centrifugue à 13.000 rpm, por 5 minutos;

1.6. Descarte o sobrenadante;

1.7. Acrescente 300 microlitros de etanol 70%, para retirar o resíduo de NaCl da amostra;

1.8. Homogeinize cuidadosamente;

1.9. Centrifugue à 13.000 rpm, por 5 minutos;

1.10. Descarte o sobrenadante;

1.11. Aguarde o etanol evaporar;

1.12. Ressuspenda o sedimento (pellet) de DNA, em 100 µL de tampão TE;

1.13. Acondicione à -20ºC, até o momento de uso.

 

TÉCNICA DE COLUNA DE SÍLICA

 

I) EXTRAÇÃO - LISE CELULAR (DIGESTÃO)

 Conforme o acima descrito.

 

I) EXTRAÇÃO – PURIFICAÇÃO (LAVAGEM)

1.1. Adicione, à amostra, 250 µL de etanol 97% a 100% ou Isopropanol;

1.2. Acondicione 30 µL da amostra em uma coluna e encaixe em um tubo tipo Eppendorf;

1.3. Centrifugue a 37ºC, a 13.000 rpm, por 5 minutos, e despreze o sobrenadante;

1.4. Adicione 500 µL de etanol 70%, ou tampão de lavagem à amostra;

Tampão de lavagem opcional:

TrisHCl 0,1 M – pH 8,0 -------------------100mL

Isotiocinato de guanidina -----------120gramas

1.5. Centrifugue a 37ºC, à 13.000 rpm, por 5 minutos, e despreze o sobrenadante;

1.6. Repita o último passo por 3 vezes.

 

III) EXTRAÇÃO – RECUPERAÇÃO (ELUIÇÃO)

1. Acondicione a coluna com a amostra em um tubo tipo Eppendorf;

1.1. Adicione à amostra, aproximadamente, 100 µL de tampão TE;

1.2. Centrifugue a 37ºC, a 13.000 rpm, por 5 minutos;

1.3. Despreze a coluna;

1.4. O sobrenadante é o seu DNA purificado;

Obs: Armazene a amostra refrigerada a -20ºC, ou a -80ºC, até o momento de uso.

 

 

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