LINFONODOS E MEDULA ÓSSEA: PROCEDIMENTOS PARA O ESTUDO HISTOLÓGICO

Linfonodos:

Os linfonodos devem ser retirados inteiros, de preferência o maior, no caso de haver com vários tamanhos, com manipulação cuidadosa, sem o uso de pinças, e sem envolvê-los em gaze ou outros meios que favoreçam o dessecamento. Se tiver menos do que 1 cm pode ser cortado longitudinalmente, no maior comprimento, sagitalmente. Se for maior, deve ser clivado em secções transversais, com 2 ou 3 mm de espessura, de modo a se preservar a observação da estrutura histológica das zonas cortical, paracortical e medular, sempre usando-se lâminas estéreis, afiadas, para não haver contaminação, devido aos estudos microbiológicos ou em biologia molecular, que venham a ser necessários.

Os preparados citológicos ("imprints") podem ser feitos tocando-se várias vezes a superfície de corte do linfonodo ao longo da superfície das lâminas de microscopia, previamente limpas, devendo-se selecionar as lâminas cujo material aderido não esteja muito úmido ou molhado. Deixa-se uma lâmina para fixação a seco (ao ar), a ser corada pelos métodos de Giemsa ou de Leishman (ou de Jenner-Giemsa ou de May-Grünwald-Giemsa), e, a outra, para fixação em álcool etílico a 95% e coloração pelo método da Hematoxilina & Eosina. Os preparados citológicos servem para o diagnóstico e para os estudos citoquímicos. No caso da suspeita de doenças infecciosas, fragmentos colhidos de modo estéril devem ser enviados para cultura microbiológica.

O fixador usualmente utilizado é a formalina a 10%, tamponada, devendo  o tempo de fixação não ultrapassar 24 horas, após o qual o tecido é processado para infiltração e emblocamento em parafina e os cortes corados pelo método da Hematoxilina & Eosina, outros métodos especiais (Giemsa), e para o estudo imuno-histoquímico.

Na necessidade de estudos especiais em Biologia Molecular, o processamento rápido e o armazenamento do material em congelador a -80^oC, ou em nitrogênio líquido, é necessário.

A existência de protocolos padronizados sobre o processamento dos materiais e a devida identificação, com número de registro próprio, de cada paciente e material, são importantes.

Referências:

Morais, J.C.O & Zerbini, M.C.N. - Linfoma de Hodgkin. In: Bacchi, C.E.; Melo, C.R.A.; Franco, M.F. & Artigiani Neto, R. - Manual de Padronização de Laudos Histopatológicos. 4^aed.; Sociedade Brasileira de Patologia; Barueri, S.P.; Manole; 2014; pp.186-7.

Raphael, S.S. (ed.) – Lynch’s Medical Laboratory Technology. 4^th ed., Philadelphia, W.B.Saunders, 1983, pp. 685-686.

Medula Óssea:

A crista ilíaca posterior costuma ser o melhor local para a realização de biopsia de medula óssea por prover osso cortical e esponjoso com medula óssea. A crista ilíaca anterior é a utilizada em pacientes obesos e imobilizados no leito. Em crianças de até 1 ano de idade a punção tibial pode ser feita para o mielograma. As amostras devem ter um tamanho mínimo de 15 a 20 milímetros.

O aspirado de medula óssea deve conter pelo menos 1 mililitro para serem feitos esfregaços (distensões) em lâminas de microscopia e citocentrifugados. No caso do mielograma o aspirado é colhido sem anticoagulante e o excedente é colocado em lâmina de microscopia para coagular e, após, o coágulo é imerso em formalina a 10%, tamponada. O citocentrifugado pode ser processado sem descalcificação, para estudos citológicos, imuno-histológicos e em biologia molecular.

Os fragmentos de medula óssea são fixados em formalina a 10%, tamponada, por cerca de 4 a 6 horas, se pequenos, e por cerca de 12 horas, se grandes. Deve-se evitar a fixação por mais de 24 horas para não comprometer o estudo imuno-histológico. Após a fixação, é feita a descalcificação em: 1) solução de ácido nítrico a 25% e formalina a 25%, por 2 horas, após os quais o fragmento é lavado e enviado para o processamento histológico, ou 2) solução aquosa de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) a 10%, pH 7,2, por no máximo 2 horas, após os quais é colocado em formalina. A descalcificação com EDTA não hidrolisa o DNA, o que ocorre com o ácido nítrico. Além dos métodos aqui citados de descalcificação, existem outros protocolos para a descalcificação, que variam segundo as soluções de ácidos utilizadas.

Além da coloração pelo método da Hematoxilina & Eosina e pelo Método de Giemsa, entre outros (Leishman, May-Günwald-Giemsa), emprega-se o Método da Reticulina para a avaliação das fibras reticulares (colagênicas e não colagênicas), aumentadas nas fibroses, e o Método de Perls para avaliar-se os depósitos de ferro na medula óssea.

Os estudos complementares compreendem os imuno-histoquímicos, em fragmentos obtidos por biopsia, permitindo-se a correlação da expressão dos marcadores antigênicos entre a estrutura histológica e as células (citopatologia), e a citometria de fluxo nos aspirados, com as células em suspensão, permitindo-se avaliar: o tamanho das células, a viabilidade celular, a granularidade do citoplasma, a fase do ciclo celular, o conteúdo de DNA (ploidia), marcadores fenotípicos de superfície, conteúdo enzimático, etc. Outros métodos em biologia molecular incluem: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e a Hibridização in situ por fluorescência (FISH) na detecção de anormalidades genéticas nas células neoplásicas hematopoéticas.

Referências:

Bachi, C.E.; Pires, A.R.C. & Duarte, I.X. - Biópsia de Medula Óssea. In: Bacchi, C.E.; Melo, C.R.A.; Franco, M.F. & Artigiani Neto, R. - Manual de Padronização de Laudos Histopatológicos. 4^aed.; Sociedade Brasileira de Patologia; Barueri, S.P.; Manole; 2014; pp. 229-234.

Rosai, J. (ed.) - Chapter 3 - Special Techniques in Surgical Pathology. In: Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. Vol. 1 e 2. 10^th ed. Edinburg, Mosby/Elsevier, 2011, pp. 63.

Raphael, S.S. (ed.) – Lynch’s Medical Laboratory Technology. 4^th ed., Philadelphia, W.B.Saunders, 1983, pp. 685-686.