RINS: PROCEDIMENTOS PARA O ESTUDO HISTOLÓGICO

Considerações Gerais

Os fragmentos de rim obtidos por biopsia por agulha requerem a presença do córtex, que pode conter de 30 a 40 glomérulos. Este número varia, sendo maior em crianças pequenas, onde os glomérulos são menores e os túbulos ainda não estão totalmente desenvolvidos quanto ao tamanho. Em pacientes com doenças renais crônicas, com atrofia tubular, os glomérulos ficam mais próximos entre si, e podem ser numerosos, mesmo em fragmentos relativamente pequenos de córtex. Apesar destas variações, um número de glomérulos entre 5 a 10 costuma ser suficiente para um diagnóstico acurado. Naturalmente, quanto maior o número de glomérulos melhor para se avaliar o diagnóstico, especialmente nas glomerulopatias com distribuição focal  e segmentar. Porém, um fragmento de biopsia pode ter tamanho adequado e, mesmo assim, não auxiliar em se determinar a gravidade de uma dada nefropatia, especialmente na glomeruloesclerose segmentar e focal e no lupus, e, também, nas nefrites intersticiais e na nefroesclerose arteriolar, onde as lesões são focais e variáveis, quanto à severidade, de um local para o outro. Na glomeruloesclerose segmentar e focal os glomérulos afetados costumam estar presentes nas áreas justamedulares, de modo que um fragmento de biopsia contendo os dois terços mais superficiais do córtex não irá permitir o diagnóstico, mesmo tendo um tamanho adequado. Por outro lado, na amiloidose e no mieloma, mesmo diante de poucos glomérulos, um ou dois, o diagnóstico é possível devido às alterações histopatológicas características que apresentam.

Nos rins obtidos em necropsias o estudo histológico acurado deve ser feito em fragmentos que incluem uratos, granulomas, evidência de pielonefrite, etc.

Microscopia óptica convencional

Os fragmentos podem ser fixados em formalina a 10%, neutra, tamponada ou em paraformaldeído a 4%. Alguns preferem as soluções fixadoras de Bouin alcoólico, de Duboscq-Brasil, ou de Zenker. Em geral, no estudo histológico renal as lesões observadas nos glomérulos, túbulos, interstício e vasos devem ser descritas, preferencialmente, nesta ordem, dando-se ênfase à lesão mais importante, quando presente. Os cortes devem ter de 2 a 4 micrometros de espessura, para não se ter uma ideia errônea, aumentada, da celularidade glomerular. Podem ser feitos de 10 a 20 cortes seriados, e estes submetidos aos seguintes métodos básicos de coloração, ou impregnação, a saber:

1) Hematoxilina & Eosina, que permite a avaliação geral da celularidade glomerular, da estrutura tubular, dos vasos e do interstício. Os núcleos são corados em azul escuro (hematoxilina) e o citoplasma e interstício em róseo (eosina).

2) Ácido Periódico-Schiff, cora em magenta, ou púrpura, as glicoproteínas neutras da matriz extracelular, intensificando as membranas basais das alças capilares glomerulares, da cápsula de Bowman e dos túbulos, incluindo as proteínas de Tam-Horsfall nas luzes tubulares, assim como o mesângio, as insudações (plasmáticas) (hialinoses) e escleroses glomerulares.

3) Tricromático de Azan, auxilia na avaliação das alças capilares glomerulares, dos túbulos e interstício; onde há maior deposição de colágeno, nas áreas de fibrose, e, em algumas situações, permite demonstrar depósitos imunes. É um método que conjuga avaliar as células e o interstício. Cora em azul a membrana basal, a matriz mesangial e as áreas de esclerose ou fibrose (colágeno); em vermelho os depósitos imunes nas membranas basais das alças capilares glomerulares. A fibrina e as insudações (hialinose) em vermelho. Os núcleos coram-se em vermelho e o citoplasma em rosa a rosa azulado.

4) Prata Metenamina de Jones, realça em negro o mesângio e a membrana basal das alças capilares glomerulares, da cápsula de Bowman e dos túbulos, e as áreas de esclerose. Pode ser contracorado com PAS. (Am J Pathol, 27: 991-1009, 1951)

Outros métodos são empregados, de acordo com as necessidades, como o de Von Kossa ou da Alizarina Red S para cálcio, do Vermelho Congo para amiloide, Picrosirius Red para colágeno, etc.

Imuno-histologia

Os fragmentos renais, a fresco, em cortes congelados em criostato, ou fixados em formalina a 10%, neutra, tamponada, usualmente são submetidos ao estudo por imunofluorescência, com anticorpos marcados com isotiocianato de fluoresceína, anti-imunoglobulinas (IgM, IgG, IgA), anticadeias leves kappa e lambda das Imunoglobulinas, antifrações do complemento (C1q, C3, C4), antifibrina, anticolágenos III e IV, antifibronectina, etc, permitindo, sob microscópio com luz ultravioleta, identificar os depósitos (granulares, semilineares e lineares) destas proteínas em marcações com fluorescência verde, nos glomérulos, na membrana basal dos túbulos ou na parede de pequenas artérias, etc, segundo as várias nefropatias primárias e secundárias, como por exemplo: 1) depósitos granulares de IgG e C3 na membrana basal glomerular na glomerulopatia membranosa, 2) depósito de IgA no mesângio na nefropatia por IgA, 3) depósitos de IgM e C3 na zona de esclerose na glomeruloesclerose segmentar e focal, 4) depósitos granulares de IgG e complemento (C1q, C3 e C4), subendoteliais, subepiteliais e mesangiais, na glomerulonefrite mesângiocapilar, 5) depósito linear de IgG na membrana basal glomerular na glomerulonefrite rapidamente progressiva tipo I (síndrome de Goodpasture), 6) depósitos de imunocomplexos no interstício e na membrana basal tubular em doenças autoimunes como, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, etc, ou doenças infecciosas como, endocardite bacteriana, mononucleose infecciosa, etc. Pesquisas semelhantes podem ser feitas por meio da imunoperoxidase, usando-se métodos de recuperação antigênica, com bons resultados. Leia mais em pdf.

Microscopia eletrônica de transmissão

Em geral, os fragmentos renais, com 1 a 3 milímetros cúbicos, são fixados em glutaraldeído a 2,5%, em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,4. Adequada fixação para a ME pode também ser obtida em fragmentos fixados com formalina a 10%, em tampão Millonig, pH 7,2 - 7,4 (310 mOsm). O estudo ultraestrutural renal tem sido útil na avaliação acurada das características, da localização precisa e da severidade de várias lesões renais, como: 1) as “corcovas” (depósitos subepiteliais na membrana basal glomerular) presentes na glomerulonefrite difusa aguda pós-infecciosa, 2) os depósitos densos entre a membrana basal glomerular e os podócitos na glomerulopatia membranosa, 3) a perda dos processos podais  e o descolamento das células epiteliais viscerais (podócitos), desnudando a membrana basal glomerular, na glomeruloesclerose segmentar e focal, 4) os depósitos eletrondensos (IgA) na matriz mesangial na nefropatia por IgA (glomerulonefrite mesangioproliferativa difusa), 5) determinar o grau de espessamento da membrana basal glomerular na glomeruloesclerose diabética, 6) a descontinuidade ou intervalos na membrana basal glomerular na glomerulonefrite crescêntica, 7) permitir a localização precisa dos depósitos de imunocomplexos nos glomérulos (mesangial, subendotelial, subepitelial ou intramembranosa), etc. Determinadas enfermidades renais somente são diagnosticadas, de modo preciso, pela microscopia eletrônica, como a doença de Alport, a doença da membrana basal fina, as lesões na nefropatia da síndrome da imunodeficiência adquirida, etc. Nas células tubulares depósitos de proteínas e gotículas de lipídeos, assim como alterações mitocondriais e no retículo endoplasmático rugoso somente podem ser claramente reconhecidos e avaliados pela microscopia eletrônica. Procedimento em MET.pdf

A avaliação histopatológica dos fragmentos renais deve ser feita por médico patologista experiente em nefropatologia e nos três métodos de estudo citados acima, e em laboratórios de referência, onde tais métodos são usualmente realizados.

Referências

Amann, K. & Hass, C.S. - What you should know about the work-up of a renal biopsy? Nephrol Dial Transplant 21: 1157–1161, 2006 pdf.

Fago, A. - WCN 2016 Histology Procedure Manual - In: http://www.theisn.org/education/education-topics/pathology-topics/item/1720-wcn-2015-histology-procedure-manual (faça download dos arquivos em pdf)

Pirani, C.L. - 2. Evaluation of kidney biopsy specimens, In: Tisher, C,G, & Brenner, B. M.- Renal Pathology with Clinical and Functional Correlations. Vol. I, Philadelphia, J.B. Lippincott, 1989, pp. 11-42.

Walker, P.D.; Cavallo, T. & Bonsib, S.M. - Practice guidelines for the renal biopsy. Modern Pathology 17: 1555–1563, 2004.pdf

Walker, P.D. - The renal biopsy. Arch Pathol Lab Med.;133:181–188, 2009. pdf