OSSOS: PROCEDIMENTOS PARA O ESTUDO HISTOLÓGICO CONVENCIONAL

Exame peroperatório

Exames peroperatórios, em cortes congelados, em criostato ou micrótomo de congelação, podem ser feitos em lesões ósseas, especialmente coletando-se as áreas periféricas da lesão com consistência amolecida, em transição ou não com os tecidos moles, sendo os fragmentos ósseos de permeio separados, antes de se fazer o processamento para os cortes congelados.  Estes podem ser corados pelos métodos rápidos da Hematoxilina & Eosina, ou do Azul de Toluidina O - Tionina. Os detalhes nucleares ficam ótimos pela coloração com o Azul de Toluidina O. O exame peroperatório permite saber se o tecido ressecado é representativo para o pronto diagnóstico de uma neoplasia, como sendo benigna ou maligna, assim como o seu grau de maliginidade, e fornece material para cultura microbiológica, estudos citogenéticos e citometria de fluxo, entre outros métodos diagnósticos especiais. Apesar das vantagens citadas é procedimento que exige patologista experiente e infraestrutura laboratorial no centro cirúrgico, não sendo, assim, colocado em prática com facilidade.

Exame pós-operatório

Os tecidos ósseos para diagnóstico pós-operatório devem ser colhidos com o envolvimento do imagenologista, do patologista e do cirurgião. Podem ser obtidos por biopsia aberta, biopsia percutânea por agulha, punção aspirativa por agulha fina, ou por ressecção do osso contendo a neoplasia. O correto diagnóstico histopatológico ósseo exige a correlação com a clínica e o diagnóstico por imagem.

Considerando-se as neoplasias, a biopsia aberta pode ser incisional, quando parte da lesão é retirada, devendo-se dar preferência às áreas de transição da neoplasia óssea com os tecidos moles comprometidos, ou excisional, quando toda a lesão é retirada, geralmente por curetagem, gerando-se muitos fragmentos. Não há um número mínimo de fragmentos a serem submetidos ao exame histopatológico, devendo-se incluir, para o estudo microscópico, todos os tecidos com diferenças macroscópicas. A vantagem da biopsia aberta é a obtenção de grande quantidade de tecido.

As biopsias percutâneas por agulha fina, geralmente, são feitas de lesões ósseas metastáticas, como os carcinomas, por exemplo.

As punções aspirativas por agulha fina, guiadas por exame de imagem, são úteis, na maioria dos pacientes, para o diagnóstico diferencial, rápido, entre as neoplasias ósseas, benignas ou malignas, primárias ou metastáticas, mieloma e linfoma. Porém, geralmente dão material com perda das inter-relações estruturais histológicas, podem gerar artefatos próprios do método, e por isso, exigem alta especialização do patologista para a reta interpretação dos achados microscópicos, devendo, assim, serem realizadas em centros de diagnóstico e tratamento de doenças musculoesqueléticas. Dependendo do tipo de lesão, nem sempre é possível fazerem-se punções aspirativas, especialmente das lesões sem partes amolecidas. Quando possível, vários aspirados devem ser feitos para se garantir tecido suficiente, os quais podem ser processados e corados pelos métodos de May-Grünwald-Giemsa e, ou da Hematoxilina & Eosina, os quais enaltecem a matriz extracelular óssea da lesão, importante na avaliação diagnóstica em microscopia óptica. Os tecidos, assim obtidos, além da avaliação em microscopia óptica convencional, podem também ser submetidos aos estudos histoquímicos, imuno-histoquímicos, genéticos (ploidia do DNA, cariotipagem, microarranjo do DNA em neoplasias), hibridização in situ, reação em cadeia da polimerase, e ao estudo em microscopia eletrônica de transmissão. Naturalmente, os tecidos ósseos obtidos por biopsias aberta e percutânea por agulha, também podem ser submetidos aos estudos especiais citados, assim como os produtos de ressecções.

As ressecções são feitas, geralmente, nos pacientes com sarcoma de alto grau, e caracterizam-se por conterem a lesão inteira junto com osso sem lesão, associada com os tecidos moles circundantes e com a elipse de pele contendo o trajeto da realização da biopsia. Os produtos de ressecção podem ser dissecados logo após a cirurgia, retirando-se os tecidos moles e seccionando-se, com serra, o osso nos planos longitudinal e medial. A superfície de corte deve ser lavada em água corrente para a retirada de todos os detritos, antes da fixação em formalina.

Fixação

Todos os tecidos ósseos podem ser fixados em solução aquosa de formalina a 10%, neutra, tamponada, por até 5 dias. Os espécimens grandes, ou espessos, devem ser serrados em fatias de 3 a 4 milímetros de espessura, antes de serem colocados na solução de formalina. Uma fixação adicional é recomendada em solução aquosa de formalina a 20%, neutra, tamponada, especialmente para os espécimens grandes. Esta formalina mais concentrada pode também ser usada para amostras teciduais menores.

  SOLUÇÃO DE FORMALINA A 20%, NEUTRA, TAMPONADA

Formaldeído (37% - 40%) ...............................................  20 mililitros

Água destilada ................................................................  80 mililitros

Fosfato de sódio, monobásico (NaH₂PO₄)....................... 4,0 gramas

Fosfato de sódio, dibásico (Na₂HPO₄)............................. 6,5 gramas

Os espécimens pequenos, provenientes de biopsia ou de curetagem, são fixados por 1 a 2 horas em formalina a 20%. Os espécimens cirúrgicos de rotina, que normalmente cabem no cassete plástico, devem ser fixados por 24 a 48 horas, e os maiores espécimens, a serem montados para corte inteiro, tais como os ossos longos, são fixados por 72 horas ou mais.

Descalcificação

Os tecidos ósseos, e não ósseos com calcificação, ou metaplasia óssea, devem ser submetidos à descalcificação, após estarem muito bem fixados, antes de continuarem o processamento histológico usual, caracterizado pela desidratação com etanol, clarificação com xileno, infiltração e emblocamento em parafina, cortes em micrótomo, desparafinação, coloração e montagem da lâmina em meio resinoso, com lamínula.

Vários métodos de descalcificação, com diversos tipos de ácidos (ácido nítrico, ácido fórmico, ácido clorídrico, ácido etilenodiaminotetraacético, etc), estão disponíveis, segundo protocolos diferentes, com vantagens e desvantagens. O uso de soluções descalcificadoras ácidas pode alterar, em graus variáveis (dependendo do tipo de ácido utilizado e do tempo de descalcificação), as estruturas químicas dos tecidos a serem emblocados em parafina, como a antigenicidade, a hidrólise do ácido nucléico, entre outras alterações, que comprometem a qualidade da coloração, nuclear, citoplasmática e extracelular, assim como gerarem-se artefatos, que simulam osteonecrose. A não lavagem adequada dos tecidos descalcificados, segundo os tipos de ácidos utilizados, favorece a descoloração dos cortes histológicos com o tempo. O uso de EDTA costuma produzir menos artefatos e alterações teciduais, que interfiram na qualidade final da coloração, porém exige maior tempo para a descalcificação. Os tecidos usualmente são testados, quanto à descalcificação, ao se tornarem maleáveis ou elásticos, podendo ser facilmente cortados, sem resistência, com uma lâmina de bisturi ou navalha descartável. Outros métodos utilizados são por testes químicos, ou radiografias. As radiografias são preferencialmente feitas nos espécimens de osso compacto, logo antes da descalcificação, como referência, e em intervalos durante o acompanhamento da descalcificação.

SOLUÇÃO DE ÁCIDO FÓRMICO A 20% EM FORMALINA A 10%

Ácido fórmico concentrado (88% a 92%)............................ 400 mililitros

Solução de formalina a 10% ........................................... 1.600 mililitros

ou

SOLUÇÃO DE ÁCIDO FÓRMICO

Ácido fórmico concentrado (88% a 92%).............................. 5 mililitros

Água destilada ou de torneira.............................................. 95 mililitros

Os fragmentos teciduais devem ser finos, com não mais do que 3 ou 4 milímetros de espessura, e colocados na solução de ácido fórmico suspensos, de modo que o cálcio retirado vá se depositando no fundo do frasco. Diariamente a solução descalcificadora deve ser trocada e a descalcificação verificada. Quando os tecidos ficarem maleáveis, moles, ou elásticos, devem ser lavados em água corrente por 4 a 8 horas. Usualmente espécimens sem osso cortical ficam descalcificados em 24 horas.

SOLUÇÃO DE ÁCIDO ETILENODIAMINOTETRAACÉTICO (EDTA)

EDTA ..................................................................................................... 10 gramas

Água destilada ou desionizada (pH 5,5 a 6,5)............. até completar 100 mililitros

A solução de EDTA é a indicada para a descalcificação de medula óssea, pois preserva as estruturas celulares e extracelulares, sem comprometimento da qualidade tintorial e favorece os estudos histoquímicos enzimáticos, particularmente a coloração para a naftol ASD cloroacetato esterase. Para os fragmentos de medula óssea, com cerca de 2 milímetros de espessura, um período de descalcificação em EDTA de 16 a 18 horas é o suficiente. Os fragmentos ósseos maiores levam 3 - 4 dias e até duas semanas para serem descalcificados em EDTA, cuja solução deve ser trocada frequentemente. Lavar os fragmentos em água corrente por horas, após a descalcificação em EDTA, não é necessário, podendo os tecidos seguirem o processamento histológico normal.

Leia mais em: Decalcification in Surgical Pathology.

Referências

Pierson, K.K. – Principles of Prosection. A Guide for the Anatomic Pathologist. New York, John Wiley & Sons, 1980, pp. 216-217.

Luna, L.G. – Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York, McGraw-Hill, 1968, pp. 9-10.

Kammerman, J.R.; Prophet, E.B. & Barnes, C.F. - Chapter 13 - Orthopedic Histotechnology, In: Prophet, E.B.; Mills, B.; Arrington, J.B. & Sobin, L.H. – Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology, Washington, D.C., 1994, pp. 71-79. Leia mais em Histotecnologia Óssea.pdf

Unni, K.K.; Inwards, C.Y.; Bridge, J.A. & Kindblom, L.G. – AFIP Atlas of Tumor Pathology Series 4. Tumors of the Bones and Joints. Washington D.C., American Registry of Pathology, 2005, pp.4-7.